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      1. 教育裝備采購網
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        連發3篇hiPSC文章,單細胞可視化培養系統顛覆傳統,分離效率高達100%!

        教育裝備采購網 2024-06-13 11:50 圍觀106次

          人類誘導多能干細胞 (hiPSC) 是通過基因編輯技術(如 CRISPR-Cas9)對已經高度分化的人體細胞進行重新逆分化得到的多能干細胞。傳統的hiPSC細胞系構建與培養過程操作復雜、耗材昂貴且費時費力。特別是對于異質編輯細胞池中構建的克隆hiPSC系的培養,受到了傳統細胞培養方法的桎梏,很難構建一個高效的hiPSC構建與培養工作流程。此外,現有的單細胞分離和培養方法通常對細胞的處理條件要求苛刻,操作步驟繁瑣,無法充分保證單克隆性。

          為應對hiPSC細胞系構建與培養過程中的諸多挑戰,iotaSicences公司采用了以GRID技術為核心的高度自動化的單細胞可視化培養系統isoCell,構建了用于 hiPSC細胞系培養的平臺。該平臺采用全自動化流程,操作條件溫和,對單細胞無損傷,具有高通量、自動化、高成活率等優勢,可確保分選出的細胞100%為單細胞。柏林醫學大學多能干細胞和類器官研究中心的Harald Stachelscheid團隊使用isoCell在Stem Cell Research期刊上發表了三篇構建不同功能的hiPSC細胞系的科研應用文章,展示了isoCell在hiPSC細胞系構建和培養方面的優勢。

        連發3篇hiPSC文章,單細胞可視化培養系統顛覆傳統,分離效率高達100%!

        圖1 單細胞可視化培養系統isoCell實物圖

          1. 以isoCell為核心的hiPSC細胞培養平臺

          isoCell系統組成的細胞培養平臺是基于GRID技術的高度自動化的實驗平臺。GRID是指在細胞培養基上采用FC40液體分隔出的網格小室,體積?。ê牟纳伲?,光學透明度高,可以容納細胞在內生長,且各個小室之間物質不流通。isoCell系統配備了熒光和成像系統,用于在整個克隆工作流程中記錄 GRID 小室的圖像(見下圖)。

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        圖2 GRID實物圖

          isoCell 可自動執行所有液體處理步驟,包括構建 GRID、將單細胞注射到GRID小室中以及交換培養基和收獲單克隆集落,在整個工作流程中自動檢測每一個 GRID 小室,并確保每一個單克隆hiPSC細胞系來源于單個細胞。

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        圖3  isoCell操作流程圖

          2. 生成具有 SLC16A2:G401R 或 SLC16A2 敲除的 iPSC系

          X染色體相關的AHDS綜合征的發病特點是由編碼甲狀腺激素轉運蛋白MCT8(單羧酸轉運蛋白8)的SLC16A2基因突變引起精神運動發育嚴重受損。

          該團隊使用CRISPR/Cas9技術(靶向 SLC16A2 的外顯子3)將AHDS患者錯義變體G401R和新型敲除缺失變體 (F400Sfs*17) 引入男性健康供體的hiPSC系(BIHi001-B)。通過isoCell培育成功地獲得了SLC16A2基因敲除的hiPSC單克隆細胞系(BIHi001-B-7)和(BIHi001-B-8),并證明了這些新細胞系在模擬 MCT8 缺陷對人類神經發育的影響方面的實用性。文章以Generation of iPSC lines with SLC16A2:G401R or SLC16A2 knock out為題發表于Stem Cell Research期刊上。

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        圖4  WB驗證SLC16A2 敲除的hiPSC系無法表達SLC16A2蛋白

          3. 生成 THRB-GS(E125G_G126S) 和 THRB-KO 人類 iPSC 系以研究非典型甲狀腺激素信號傳導

          THRB是一種依賴甲狀腺激素 (TH) 結合來調節基因表達的核受體。相同的受體也可以介導細胞質中信號通路的激活。目前尚無法區分這兩種機制中的哪一種是造成 TH 生理效應的原因。

          該團隊結合基因編輯與isoCell的單細胞培養基技術,成功建立了一種在 THRB DNA 結合域中具有兩個突變 (E125G_G126S) 的hiPSC 細胞系(BIHi001-B-2/3),該突變消除了THRB的核受體作用,因此可以用該細胞系專門研究THRB的信號通路激活作用。該團隊還生成了 THRB 敲除細胞系(BIHi001-B-6)以消除所有 THRB 效應。通過比較WT結果和這兩種細胞系,將甲狀腺激素的影響歸因于潛在的機制。文章以Generation of THRB-GS(E125G_G126S) and THRB-KO human iPSC lines to study noncanonical thyroid hormone signalling為題發表于2024年2月的Stem Cell Research期刊上。

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        圖5  基因測序驗證BIHi001-B-2/3和BIHi001-B-6細胞系敲除或突變了對應基因

          4. 使用 CRISPR-Cas9 生成了兩個 BAX/BAK 雙敲除人類誘導多能干細胞系 (iPSC)

          腦缺血損傷很多是由于腦缺血狀態下細胞凋亡導致的。Bcl-2基因相關的X 蛋白 (BAX) 和BCL2 拮抗因子/殺手1(BAK)是 BCL2 家族的兩個促凋亡因子,BAX 和BAK是線粒體凋亡的執行基因,與細胞凋亡密切相關。

          該團隊使用 CRISPR-Cas9技術構建了兩個 BAX/BAK 雙敲除人類誘導多能干細胞BIHi005-A-17和BIHi250-A-1,并通過isoCell培養獲得了對應的hiPSC單克隆細胞系。所得細胞系核型正常,具有典型的形態并表達未分化狀態的典型標記,并通過基因技術驗證了細胞系已敲除BAK基因。在后續的研究中,研究人員就可以將該BAX/BAK 雙敲除的hiPSC細胞系廣泛應用于腦缺血等細胞凋亡相關領域的發病機制與治療干預機制研究中。文章以Generation of two human induced pluripotent stem cell lines with BAX and BAK1 double knock-out using CRISPR/Cas9為題發表于2024年4月的Stem Cell Research期刊上。

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        圖6 通過基因測序及WB驗證BIHi005-A-17和BIHi250-A-1以敲除BAK與BAX基因

          5. 結論

          以isoCell構建的hiPSC細胞培養平臺可以對hiPSC細胞進行全自動化且溫和地單細胞培養。通過isoCell特有的GRID小室網格技術與可視化分選相結合,可以確保每一個單克隆hiPSC細胞系均來自單個細胞,且節省培養耗材。

          isoCell的培養條件溫和,在以上案例中協助科研人員構建了多個基因改造hiPSC單克隆細胞系,成活率高。

          單細胞可視化培養系統isoCell的優勢:

          ? 全自動化流程

          ? 操作條件溫和,對單細胞無損傷

          ? 全培養、分析流程可追蹤

          ? 單細胞率高達100%

          ? 單克隆細胞系構建成活率高

          ? 結構緊湊,體積小,節省耗材

          單細胞可視化分選培養系統-isoCell已在Cell、Advanced Science、Small Methods、Nature Communications等知名期刊發表多篇文章,如下摘引了近年三篇具有代表性的文獻和大家分享。

        • Soitu C, Stovall‐Kurtz N, Deroy C, et al. Jet‐Printing Microfluidic Devices on Demand[J]. Advanced Science, 2020, 7(23): 2001854.

        • Gangoso E, Southgate B, Bradley L, et al. Glioblastomas acquire myeloid-affiliated transcriptional programs via epigenetic immunoediting to elicit immune evasion[J]. Cell, 2021, 184(9): 2454-2470. e26.

        • Deroy C, Nebuloni F, Cook P R, et al. Microfluidics on Standard Petri Dishes for Bioscientists[J]. Small Methods, 2021, 5(11): 2100724.

        • Deroy C, Wheeler J H R, Rumianek A N, et al. Reconfigurable microfluidic circuits for isolating and retrieving cells of interest[J]. ACS Applied Materials & Interfaces, 2022, 14(22): 25209-25219.

        • Oliveira N M, Wheeler J H R, Deroy C, et al. Suicidal chemotaxis in bacteria[J]. Nature Communications, 2022, 13(1): 7608.

          樣機體驗:

          為更好地服務中國科研工作者,Quantum Design 中國也建立了樣機演示實驗室,將為大家提供為專業的售前、銷售、售后技術支持,歡迎各位老師通過撥打電話010-85120280、發送郵件info@qd-china.com、點擊此處掃描下方二維碼參觀試用!

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          路易莎·埃姆斯,研究科學家:

          The Native Antigen Company(LGC 臨床診斷集團旗下公司)

          “使用 isoCell 進行單細胞克隆工作從一開始就簡單可靠,并且已無縫地融入我們的流程中。 該程序對細胞很溫和,我們看到非常好的存活率,可以篩選大量克隆。 我們收到的客戶服務是優質的?!?/p>

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